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第七十八章 地下实验室基地的成果（第3页）

“你们的研究成果好像有那么点作用！这些研究成果可以抵扣你们的罪孽了！以后把重点放在研究上！你们需要什么东西，找我！包括天材地宝！”

三位白须老者脸色一下子舒展了！这是看到了活下去的希望！

本研究通过表征矮牵牛三磷酸腺苷结合盒（ABC）转运体PhABCG1功能，证明挥发物通过质膜依赖于主动转运。通过RNAi下调PhABCG1导致挥发物排放减少，挥发物在质膜中也会积累到毒性水平。转运体可以调节其他植物和其他生物体内挥发性有机化合物的排放，这项研究提供了生物学介导挥发性物质排放的直接证据。

研究结果

1.矮牵牛花RNA-seq结果分析：获取得到高表达基因PhABCG1

以矮牵牛（Petuniahybrida）的花为研究对象，研究其挥发性苯和苯丙物质是否依赖于蛋白质介导的出口。由于某些非挥发性疏水性化合物，如蜡和二萜，通过三磷酸腺苷结合盒（ABC）转运体通过质膜输出，作者搜索了牵牛花花瓣RNA测序（RNA-seq）数据集，以获取ABC转运体转录序列。在矮牵牛花中发现了一个高表达的候选基因，在第1天（花蕾期）和开放后第2天（花期）之间上调了103倍，这两个发育阶段分别是VOC排放量最低和最高的。该基因编码矮牵牛ABC亚家族G成员1PhABCG1，这是一种预测的功能未知的质膜转运蛋白，几乎只在开放花的花瓣中表达，并受ODORANT1转录因子调控，该转录因子控制矮牵牛花中VOC的生物合成。

2.PhABCG1参与VOC运输初步验证：PhABCG1RNA干扰系中VOC排放减少，细胞内部VOC增加

为了确定PhABCG1是否参与VOC的释放，作者在花瓣特异性芳樟醇合成酶启动子的控制下，制备了转基因矮牵牛花RNA干扰（RNAi）系，以降低PhABCG1的表达。三个独立系PhABCG1转录水平降低了70-80%（图1A），VOC总排放量减少了52-62%（图1B），同时内部VOC总库增加了101-157%（图1B）。在PhABCG1-RNAi花中，每个个体VOC的排放量都有不同程度的减少，其对应的内部库增加。转基因花的醇苷含量约为野生型花的2.5倍，占总VOC池的13%。

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图1.VOC释放变化情况

2.PhABCG1运输活性验证：PhABCG1转运苯丙类和苯类化合物

（）;（）　　作者首先在烟草亮黄2（BY-2）悬浮细胞中表达了his-strepii标记的PhABCG1。在50个筛选的转化子中，大多数转化子给出了接近预期分子质量（75.2kDa）的阳性信号。作为一个半大小的ABC转运体，PhABCG1具有单一膜结构域和单一核苷酸结合结构域，可以作为同源或异源二聚体发挥作用。由于没有其他半大小的ABCG基因在花中像PhABCG1那样上调，因此假设PhABCG1作为同二聚体起作用。当进行色谱时，PhABCG1在158kDa标记物前洗脱，与洗涤剂胶束（~70kDa）中预测的同型二聚体尺寸（2×75.2kDa）一致。

其次作者选择了苯甲酯和苯甲醇作为底物（矮牵牛花释放的主要VOC成分）。在用14c标记的底物孵育表达PhABCG1的对照和转基因BY-2系时，测量细胞相关的放射性，对应于被动扩散进入细胞和主动运输出细胞之间的差异。与对照细胞相比，在转基因BY-2细胞中观察到的细胞相关放射性降低，这表明PhABCG1将甲酸酯和苯甲醇运输出细胞（图2，A和C）。另外两个转基因BY-2细胞系也显示出类似的结果（图2C）。表达BY-2抗体的细胞系SC6（26）作为阴性对照，表现与野生型细胞相似。钒酸盐是一种已知的ABC转运蛋白抑制剂，在表达PhABCG1的BY-2细胞系中，苯甲酸甲酯的保留量增加了51%，证实了转运的活性（图2B）。用标记的单萜薄荷醇和二萜核醇类似物[3h-十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基-1-萘乙醇，烟草NtPDR1转运体的底物进行转运试验显示，表达PhABCG1的细胞和野生型BY-2细胞之间没有差异（图2C）。这一结果表明PhABCG1转运苯丙类和苯类化合物。

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图2.PhABCG1运输活性验证

3.其他ABCG转运体候选者筛选：未筛选到功能基因

在RNA-seq数据集中确定了16个额外的ABCG转运体候选者。在植入后的第2天，所有候选基因的转录水平都低于PhABCG1，只有两个候选基因（Ph4681和Ph5139）在第2天比第1天上调。Ph4681的表达量为PhABCG1的0.5%，而Ph5139的表达量为PhABCG1的17%。然而，短暂的RNAi下调Ph5139对VOC排放或内部池没有影响。

通过RNA-seq鉴定的所有矮牵牛花ABCG转运蛋白和已知功能的半大小拟南芥转运蛋白的系统发育分析显示，PhABCG1具有一个与矮牵牛花密切相关的蛋白Ph19708（65%氨基酸同源），没有拟南芥同源物。Ph19708的表达量是PhABCG1的0.2%，表明它对VOC排放的贡献很小，如果有的话。另外两个PhABCG1同源物（Ph13519和Ph9795，与PhABCG1共享约45%的氨基酸同源性）与已知的三个拟南芥ABCG转运蛋白（AtABCG11，AtABCG12和AtABCG13）聚集，并与PhABCG1和Ph19708单独聚集。

4.模型预测验证：累积的VOCs对膜完整性有不利影响

为了验证预测的模型，累积的VOCs对膜完整性有不利影响，作者用两种具有不同作用模式的化合物对2日龄野生型和PhABCG1-RNAi花的牵牛花花瓣进行了染色。第一种是碘化丙啶，只有在质膜被破坏时才扩散到细胞中并染色核酸。第二种是双醋酸荧光素，它穿过完整的细胞膜并保持无色，直到醋酸部分被细胞内酯酶除去。去乙酰化的荧光素是荧光的，不能穿过完整的细胞膜。

结果发现在PhABCG1-RNAi花瓣中，碘化丙啶染色细胞核，与累积的VOCs对质膜的损伤一致（图3A）。与这种效果类似，野生型花在喂食高浓度（15至30mM）苯甲醛时也表现出类似的染色。PhABCG1-RNAi花瓣中荧光素染色较少（图3B），为细胞膜破坏提供了独立的证据。与对照相比，PhABCG1-RNAi系的花更小，鲜重也更轻。然而，转基因和野生型花瓣表皮锥形细胞的扫描电镜显示，细胞基部直径和细胞形状没有差异。这表明这些细胞的分化和扩张发生在VOC积累之前，因此不受影响。

PhABCG1下调对矮牵牛花细胞膜完整性的影响

挥发性有机物因为其挥发特性，研究起来的难度要高于非挥发性代谢物，而其种类多样性也赋予其高度参与植物的各种生理活动。因此对于挥发性有机物的研究有助于我们了解植物-植物之间，植物-微生物，植物-动物之间的交流机制。迈维代谢也在过去的一年中，深耕于挥发性有机物检测的技术开发，目前提供两种检测技术：GC-MS挥发性代谢组和GCxGC全二维挥发性代谢组，可以实现对植物、食品等多种样本类型中的挥发性有机物全面检测。

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